Cas12b – Wikipedia

Cas12b (von engl. CRISPR-associated, synonym C2c1) ist ein Enzym aus der Gruppe der Endonukleasen und ein Ribonukleoprotein. Es kommt unter anderem in Alicyclobacillus acidoterrestris und Bacillus hisashii vor. Es wird bei der CRISPR/Cas-Methode verwendet, genauer: bei der CRISPR/Cas12b-Methode.

Cas12b ist ein Cas-Protein der Klasse II Typ V-B und kommt in Bakterien als Teil der adaptiven antiviralen Immunantwort mit CRISPR vor.^[1] Es bindet RNA mit einer crRNA repeat-Sequenz, die wiederum eine tracrRNA bindet. Auf die crRNA repeat-Sequenz folgt eine crRNA spacer-Sequenz, die per Basenpaarung an virale DNA bindet. Daraufhin wird in der viralen DNA durch die Endonukleasefunktion ein Doppelstrangbruch erzeugt. Bei einer Verwendung von Cas12b im Rahmen der CRISPR/Cas-Methode wird die crRNA spacer-Sequenz geändert, um an eine Ziel-DNA zu binden. In der Ziel-DNA muss ein Protospacer Adjacent Motif (PAM) der Sequenz TTN (Thymidin-Thymidin-beliebiges Nukleotid) vorkommen.^[1] Der Schnitt der Ziel-DNA erzeugt einen sticky end mit einem 5'-Überhang von 6–8 Nukleotiden 14–17 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem non-target-Strang bzw. 23–24 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem target-Strang.^[1] Cas12b schneidet DNA bei einer Temperatur zwischen 37 und 60 °C,^[1] das Temperatur-Optimum liegt bei 48 °C.^[2] Im Vergleich zu Cas9 oder Cpf1 (synonym Cas12a) erzeugt Cas12b weniger unspezifische Schnitte.^[3]

Cas12b aus Bacillus hisashii, abgekürzt BhCas12b, ist mit 1108 Aminosäuren kleiner als SpCas9 (1368 Aminosäuren) und hat daher auch ein kleineres Gen, was die Verwendung in viralen Vektoren (insbesondere AAV-Vektoren) erleichtert.^[4] Allerdings erzeugt der Wildtyp von BhCas12b bei 37 °C nur Einzelstrangbrüche.^[4] Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt (K846R/S893R/E837G), die auch bei der Körpertemperatur von Säugetieren Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt.^[4]

• I. Jain, L. Minakhin, V. Mekler, V. Sitnik, N. Rubanova, K. Severinov, E. Semenova: Defining the seed sequence of the Cas12b CRISPR-Cas effector complex. In: RNA biology. [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] August 2018, doi:10.1080/15476286.2018.1495492, PMID 30022698.

1. ↑ ^{a b c d} UniProt T0D7A2: cas12b - CRISPR-associated endonuclease Cas12b - Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) - cas12b gene (uniprot.org) (englisch) vom 16. Oktober 2013, abgerufen am 24. Januar 2019
2. ↑ S. Shmakov, O. O. Abudayyeh, K. S. Makarova, Y. I. Wolf, J. S. Gootenberg, E. Semenova, L. Minakhin, J. Joung, S. Konermann, K. Severinov, F. Zhang, E. V. Koonin: Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. In: Molecular cell. Band 60, Nummer 3, November 2015, S. 385–397, doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008, PMID 26593719, PMC 4660269 (freier Volltext).
3. ↑ L. Liu, P. Chen, M. Wang, X. Li, J. Wang, M. Yin, Y. Wang: C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism. In: Molecular cell. Band 65, Nummer 2, Januar 2017, S. 310–322, doi:10.1016/j.molcel.2016.11.040, PMID 27989439.
4. ↑ ^{a b c} Jonathan Strecker, Sara Jones, Balwina Koopal, Jonathan Schmid-Burgk, Bernd Zetsche, Linyi Gao, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin & Feng Zhang: Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. In: Nature Communications. Band 10, Nummer 1, Januar 2019, S. 212, doi:10.1038/s41467-018-08224-4, PMID 30670702.